紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum)为多年生、丛生状常绿半灌木植物, 是一种世界性恶性杂草, 生计力强、化感作用热烈[1-3]。紫茎泽兰植株中富含自然活性物资肛交 哭, 其索求物对多栽种物具有热烈的化感作用, 权贵阻难植物的滋长发育, 有望被开拓成植物源除草剂应用于杂草的绿色防控。郑丽等[4]报说念, 2.5%的紫茎泽兰叶片水索求液权贵的阻难细叶苦荬、莎草砖子苗、无芒虎尾草、紫花大翼豆、白三叶等种子萌生和幼苗滋长。王亚麒等[5]报说念, 100 mg/L的紫茎泽兰浸提液对白三叶、黑麦草和紫花苜蓿种子发芽和幼苗滋长均有权贵的阻难作用。
稗草(Echinochloa crusgalli)、灰绿藜(Chenopodium glaucum)和反枝苋(Amaranthus retroflexus)别离是禾本科、藜科和苋科杂草均分散最广, 危害最为严重的杂草, 世俗分散于寰宇各地, 常以上风草种生于农田, 危害农作物的滋长, 相当是稗草, 2012年来在我国也曾飞腾为水稻产区第一恶性杂草, 影响水稻的产量及品性。多年来, 对这3种杂草的防除, 多遴荐东说念主工废除和使用化学除草剂的步调, 不仅耗尽无数的东说念主力且无数使用化学除草剂除对生态环境也变成了一定的破损[6-7]。作家前期推敲发现, 紫茎泽兰索求物对反枝苋和灰绿藜种子萌生和幼苗滋长有权贵地阻难作用, 对幼苗活性氧代谢水平有赫然的影响[8]。关联词, 紫茎泽兰索求物阻难两种杂草的细胞生理机制还不明晰, 紫茎泽兰索求物对稗草是否也有化感作用未见报说念。为此, 本执行以上述3种主要的田间杂草为推敲对象, 重心从细胞生理学角度, 推敲了紫茎泽兰索求物对3种杂草幼苗根和根旯旮细胞化感作用的影响, 旨在明确紫茎泽兰索求物对3种杂草化感恫吓的生理机制, 为紫茎泽兰索求物开拓成植物源除草剂应用于3种杂草绿色防控提供表面依据。
1 材料与步调 1.1 执行材料紫茎泽兰索求物的制备步调：集会紫茎泽兰老到叶, 室温下阴干, 离散机离散, 过40目筛, 用95%的酒精浸泡72 h索求3次。浸提液用砂芯抽滤器(微孔滤膜孔径为0.45 μm)过滤, 并吞浸提液。浸提液用旋转蒸发器经减压浓缩撤除大部分酒精, 得到浓稠的索求物。将索求物溶于适量水中制成混悬液, 然后用石油醚进行萃取, 共萃取5次。萃取物再用旋转蒸发器经减压浓缩后, 置低温真空干燥箱中蒸发掉石油醚得到紫茎泽兰索求物, 4℃低温下避光保存备用。在使用时, 称适量紫茎泽兰索求物, 先用少许丙酮溶化(每克索求物5 mL丙酮), 再配制成不同浓度的索求物水溶液。
供试杂草稗草(Echinochloa crusgalli)、灰绿藜(Chenopodium glaucum)和反枝苋(Amaranthus retroflexus)的种子均集会于山西农业大学园艺站。
1.2 材料培养和紫茎泽兰索求物搞定挑选均匀弥漫的3种杂草种子适量, 用0.1% HgCl2消毒5 min, 然后用蒸馏水洗去HgCl2残液, 再用滤纸吸干种子名义水分。遴荐纸鬈发芽的步调, 反枝苋和灰绿藜别离取100粒、稗草取50粒种子均匀摆放在18 cm×25 cm滤纸的中上部, 盖上同等大小的滤纸, 注意将滤纸卷成纸卷。每4个纸卷用橡皮筋扎为一组(4次重迭), 置于300 mL烧杯中, 进行不同浓度的索求物搞定(Extracts treatment, ET), 并以蒸馏水搞定手脚对照。奉行中发现, 3种杂草种子对ET溶液的恫吓敏锐经过不同, 尤其是反枝苋, 经浓度高于600 mg/L ET搞定4天后, 有烂苗甘愿。为便于统计3种杂草种子萌生筹办, 设定稗草和灰绿藜种子的ET浓度为250、500、750 mg/L和1000 mg/L, 而反枝苋种子的ET浓度为150、300、450 mg/L和600 mg/L。将烧杯置于25℃培养箱中, 阴晦下进行种子发芽执行, 每天统计种子的各项发芽筹办, 种子萌生滋长8 d截止执行。此外, 按影调换的步调进行种子萌生, 缔造对照和一个较高浓度的ET(1000 mg/L)对3种杂草种子进行搞定, 种子萌生滋长至4 d时, 取活的幼苗根尖用于根尖电镜扫描样品的制作。
将消毒的双层纱布用橡皮筋固定在500 mL烧杯口上, 然后每个杂草品种取200粒消毒的种子置于纱布上, 再在种子上隐敝一层滤纸和一层脱脂棉。在脱脂棉上别离均匀滴加15 mL蒸馏水(手脚对照)或500、750 mg/L和1000 mg/L的ET, 再用保鲜膜顽固。将烧杯置25℃培养箱内, 进行幼苗根悬空培养。待3种杂草对照的幼苗根长约20 mm时, 进行如下搞定：(1)不同杂草每搞定挑选50个均匀一致的根尖制备根旯旮细胞悬液, 用于测定根旯旮细胞(RBC)数、活率、凋一火率、黏胶层厚度。(2)不同杂草每搞定别离取5个根尖, 用刀片切取约10 mm长的根尖用于根尖和根尖原位旯旮细胞的显微不雅察拍照。
同上述幼苗根悬空培养步调, 进行3种杂草根悬空培养(不进行ET恫吓), 待杂草幼苗根滋长至约5 mm时, 对杂草根尖每隔1 h喷施蒸馏水(手脚对照)或500、750 mg/L和1000 mg/L的ET, 邻接喷施5次, 再滋长12 h后切取幼苗根尖, 测定其根冠果胶甲基酯酶(PME)活性。
1.3 测定筹办与步调不同杂草种子发芽和幼苗滋长筹办的统计按种子侦查规程[9]统计各搞定的种子发芽率、发芽势(G)= Ga/Gn×100%(Ga：3d发芽种子数；Gn：供试种子数)、发芽指数(GI)= Σ(Gt·Dt-1)(Gt：t d内发芽种子数；Dt：发芽天数)、种子活力指数(VI)= GI ×W(W：单株幼苗平均鲜重)、茎长阻难率=(对照茎长－搞定茎长)/对照茎长、根长阻难率=(对照根长－搞定根长)/对照根长、幼苗鲜重。其中, 茎长阻难率、根长阻难率、幼苗鲜重每搞定取20株幼苗取平均值。每搞定重迭4次。
根尖电镜扫描样品的制作与不雅察参照范华等[10]的步调：切取对照和1000 mg/L ET溶液恫吓搞定的根尖冒昧10 mm, 赶快放到3%戊二醛固定液中, 0—4℃下固定2 d。用磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L, pH=7.2)洗涤3次, 每次15 min, 挨次用30%, 50%, 70%, 80%, 90%和95%的酒精系列脱水(每一梯度脱水15 min), 100%的酒精脱水两次, 每次20 min, 之后叔丁醇置换。样品用JEOL JFD-320冷冻干燥, 将干燥好的材料用导电胶带粘在样品台上, 用JEOL JFC-1600离子溅射镀膜仪喷镀铂金, 喷镀好的材料放入JEOL JEM-6490 LV扫描电子显微镜下不雅察拍照。
根旯旮细胞(RBC)活性测定及根尖旯旮细胞原位不雅察RBC活性测定参考胡贤良等[11]的步调。不同杂草, 每搞定挑选50个均匀一致的根尖, 切取5 mm将其浸泡在盛有200 μL蒸馏水的离心管中, 飘浮器飘浮30 s, 取出根尖再用50 μL的蒸馏水冲洗两次。集会细胞悬液转入微量打针器(规格1000 μL)挤压3次, 使成团的旯旮细胞分离开。将细胞悬液4 ℃下500 r/min离心3 min, 弃去部分上清液, 取得细胞分散均匀、浓度稳健的细胞悬液备用。取50 μL RBC悬浮液, 加入20 μL AO-EB复合染液(AO:EB= 1:1), 充分混匀, 避光染色1 min。取少许悬液, 加入血细胞计数板, 在Olympus BX 53(U-RFL-T)荧显豁微镜(蓝色激励光)下不雅察记载根旯旮细胞总额, 活细胞和死细胞数目(活细胞呈现绿色荧光, 死细胞呈橘红色或红色荧光)。细胞活率=(活细胞数/总额细胞)×100%。每搞定重迭5次；每搞定切取5个根尖置载玻片上, 滴加少许AO-EB复合染液立即在显微镜下不雅察拍照。
RBC凋一火率的测定取50 μL备用的细胞悬液, 加入75 μL Hochest-33258染液, 暗处染色5 min, 吸取少许悬液, 加入血细胞计数板, 在紫外UV激励光下不雅察活细胞与凋一火细胞的形态特征并计数[12]。
RBC黏胶层厚度的测定取50 μL备用的细胞悬液, 与50 μL的墨水(India ink)混匀染色5 min, 取少许搀杂液滴在载玻片上, 盖片, 在荧显豁微镜下不雅察测量。RBC的黏胶层厚度测量, 不同搞定测定10个细胞, 每个细胞测3个不同位置取其平均值[13-14]。
根冠果胶甲基酯酶(PME)活性测定参照胡贤良等[11]的步调。不同杂草, 速即剪取不同搞定长约5 mm的根尖30个, 加入400 μL PME索求液(内含0.2 mol/L Na2HPO4, 0.1 mol/L柠檬酸, 1 mol/L NaCl, pH=5.8), 冰浴研磨后震撼至离心管中, 再用400 μL PME索求液清洗研钵1次, 并吞入离心管中, 置于4℃雪柜中, 每隔20 min飘浮1次, 1 h后, 4℃ 15000 r/min离心10 min。取300 μL酶液加入4 mL PME底物溶液(内含0.5% w/v果胶, 0.05% w/v甲基红, 0.2 mol/L NaCl, pH=6.8), 37℃水浴2 h, 525 nm波长下测定OD值, 左证程序弧线计较PME活性, 活性单元为μmol H+/根尖数/h。每搞定重迭3次。
1.4 数据统计及分析所罕见据的统计分析均遴荐DPS 6.5软件搞定, 遴荐Duncan新复极差测验法进行数据相反权贵性侦查(P＜0.05)。期骗Excel 2007进行数据整理和绘画, Adobe Photoshop CS5扶直图片整理。
2 遵循与分析 2.1 不同浓度紫茎泽兰索求物对3种杂草种子萌生滋长的影响图 1执行遵循标明, 750 mg/L以上浓度的紫茎泽兰索求物恫吓权贵地阻难稗草种子的萌生滋长。750 mg/L索求物恫吓搞定与其对照比, 种子的发芽势、发芽率、活力指数和幼苗鲜重别离镌汰了24.7%、6.8%、29.4%和31.2%, 幼苗茎长阻难率和根长阻难率别离达到44.0%和80.8%；250 mg/L以上浓度索求物恫吓权贵地阻难灰绿藜种子的萌生滋长。250 mg/L索求物恫吓搞定与其对照比种子的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数和幼苗鲜重别离镌汰了32.5%、20.7%、23.3%、30.2%和5.1%, 幼苗茎长阻难率和根长阻难率别离达到12.7%和60.8%；150 mg/L以上浓度索求物恫吓权贵地阻难反枝苋种子的萌生滋长。150 mg/L索求物恫吓搞定与其对照比种子的发芽势和发芽指数别离镌汰了34.8%和20.2%, 幼苗茎长阻难率和根长阻难率别离达到7.8%和23.4%；从图 1执行遵循详尽分析, 3种杂草对紫茎泽兰索求物恫吓的敏锐经过反枝苋＞灰绿藜＞稗草。
2.2 紫茎泽兰索求物对3种杂草根尖和根旯旮细胞恫吓伤害的形态不雅察从图 2可看出, 电子显微镜下, 3种杂草对照幼苗根尖细胞陈设细巧, 根尖无毁伤甘愿。较高浓度(1000 mg/L)紫茎泽兰索求物搞定对3种杂草幼苗根尖均有不同经过的伤害。索求物搞定使稗草根尖发生肿胀变形, 但根尖组织结构未遭破损。索求物搞定导致灰绿藜根尖抽缩、干瘪变形。索求物搞定使反枝苋根尖组织结构遭到严重破损, 根尖上层细胞衰败, 内层细胞陈设紊乱且疏松。
光学显微镜下(图 3), 3种杂草对照幼苗根尖均可倡导地不雅察到根尖周围附着无数活的旯旮细胞, 根尖结构齐全且保捏生计力。1000 mg/L紫茎泽兰索求物搞定, 3种杂草根尖组织和细胞以及根旯旮细胞无数被杀死, 根旯旮细胞数目减少。
2.3 不同浓度紫茎泽兰索求物恫吓对3种杂草根旯旮细胞数目和活率的影响光学显微镜下, 稗草根旯旮细胞的形态大部分呈现梭形、卵形或杆状, 细胞较小。灰绿藜、反枝苋根旯旮细胞多数呈杆形、眉月形或弧形, 细胞广博较大。3种杂草活细胞均呈绿色, 死细胞为红色和橘红色(图 4)。
执行遵循标明(图 5), 紫茎泽兰索求物搞定权贵阻难3种杂草RBC的数目, 索求物浓度越高阻难作用越热烈。1000 mg/L索求物搞定, 稗草、灰绿藜、反枝苋RBC数比其对照别离镌汰了44.5%、48.3%和64.0%(图 4A)；索求物搞定还权贵阻难3种杂草RBC的活率。1000 mg/L索求物搞定, 稗草、灰绿藜和反枝苋的RBC活率别离比其对照镌汰了92.2%、62.4%和78.6%(图 4B)。
2.4 不同浓度紫茎泽兰索求物恫吓对3种杂草根旯旮细胞凋一火率的影响图 6可见, Hoechest-33258染色的3种杂草往常根尖RBC形态呈蓝色且质料均匀一致, 细胞核轮廓倡导且呈现较小的蓝色亮斑；出现凋一火甘愿的RBC形态不均匀, 细胞有片状浅蓝色片断或细胞核呈现弥漫状轮廓不限定较大的亮斑。
从图 7不错看出, 紫茎泽兰索求物搞定, 随索求物浓度的升高, 3种杂草RBC的凋一火率均持重增大。500 mg/L索求物搞定, 反枝苋、灰绿藜、稗草RBC凋一火率别离比其对照升高了115.5%、83.6%和26.7%。1000 mg/L索求物搞定, 反枝苋、灰绿藜和稗草RBC凋一火率别离达97.1%、91.3%和81.7%。说明, 反枝苋RBC对索求物恫吓的安然相对较弱。
2.5 不同浓度紫茎泽兰索求物恫吓对3种杂草根旯旮细胞黏胶层厚度的影响从图 8和图 9可知, 随索求物浓度的升高, 3种杂草RBC的黏胶层厚度均持重增大。500 mg/L索求物搞定, 稗草、灰绿藜和反枝苋RBC的黏胶层厚度比其对照别离加多了26.7%、17.4%和20.1%, 均达到权贵相反。1000 mg/L索求物搞定, 稗草、灰绿藜和反枝苋RBC的黏胶层厚度比其对照比别离加多了99.0%、65.5%和61.1%。说明, 紫茎泽兰索求物带领杂草RBC黏胶层增厚。
2.6 不同浓度紫茎泽兰索求物恫吓对3种杂草根冠果胶甲基酯酶(PME)活性的影响从图 10不错看出, 750 mg/L和1000 mg/L索求物搞定, 反枝苋PME活性与其对照比别离升高了4.7%和6.1%, 均达到权贵相反。1000 mg/L索求物搞定, 灰绿藜PME活性与其对照比升高了5.6%, 也达到权贵相反。而稗草经500、750 mg/L和1000 mg/L索求物恫吓搞定, PME活性与其对照比无赫然变化。这可能与其相对耐索求物恫吓连络。
3 考虑细胞毒性是化感物资作用的一个攻击特点[15], 化感物资与受体植物细胞名义互相作用, 破损细胞的里面结构, 干涉细胞有丝分裂和基因抒发, 导致受体植物滋长发育受阻[15-17]。从本推敲遵循看, 跟着紫茎泽兰索求物搞定浓度的升高, 3种杂草的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数等持重镌汰, 幼苗的茎长阻难率、根长阻难率增大, 幼苗鲜重镌汰。这一遵循说明, 紫茎泽兰索求物对3种杂草种子萌生滋长产生细胞毒性, 从而阻难种子的萌生和幼苗滋长。Yang等[18]曾报说念, 紫茎泽兰主效化感物资DTD(泽兰二酮)和HHO(羟基泽兰酮)导致水稻根尖组织紊乱, 细胞萎缩。本推敲中较高浓度的紫茎泽兰索求物搞定使稗草根尖发生肿胀变形, 灰绿藜根尖抽缩、干瘪, 反枝苋根尖组织结构严重被破损, 根尖上层细胞衰败, 内层细胞陈设紊乱(图 2), 与其遵循相近似。因此意料, 执行中使用的紫茎泽兰索求物中可能含有DTD和HHO这两种物资, 有待对索求物进行进一步的分离、纯化和已然并加以阐述。
根旯旮细胞是从根冠名义衰败下来并聚会在根部周围的一群特化细胞, 畴昔东说念主们广博以为RBC莫得活性[19]。关联词进一步的推敲标明, 多栽种物的RBC脱离母体前的存活率提高90%[20]。本推敲发现, 3种杂草稗草、灰绿藜和反枝苋的RBC的数目和活率存在品种相反, 与Cai等[13]的推敲遵循发现相一致。稗草的RBC数目和脱离根尖后的活细胞较多, 而灰绿藜和反枝苋较少, 这可能是由于稗草、灰绿藜和反枝苋分属不同的科属原因所致, 与其物种自己的特点连络。
化感恫吓带领细胞凋一火, 当受到某些高毒性的化感物资恫吓时, 受体植物细胞出现细胞凋一火的特征, 如细胞核出现弥漫甘愿等[21], 严重时不错引起细胞的示寂[12]。本推敲发现, 紫茎泽兰索求物恫吓, 3种杂草根旯旮细胞Hoechest-33258染色后部分细胞有的形态不均匀, 细胞有片状浅蓝色片断, 有的细胞细胞核呈现不限定较大的亮斑, 出现弥漫甘愿。说明, 索求物恫吓带领细胞凋一火, 最终引起细胞示寂。从3种杂草的根旯旮细胞AO-EB染色发现, 随索求物浓度的升高, 3种杂草的根旯旮细胞呈现红色或橘黄色细胞的数目在增多, 这也径直说明了索求物恫吓, 镌汰了根旯旮细胞活率的执行甘愿。
当植物根遭到有毒物资和微生物恫吓时, 根系旯旮细胞保护植物根尖顽抗外界有毒物资和微生物的危害[22]。根旯旮细胞从根尖分离后自主进行吐故纳新, 向外分泌一系列化学物资包被在旯旮细胞的外侧组成黏胶层, 对根旯旮细胞具有保护作用[23]。当根旯旮细胞受到生物或非生物恫吓时赶快向胞外开释多种化学物资, 使黏胶层进一步增厚, 以吸附或甩掉病原体[24], 螯合有毒物资[25], 缓解恫吓带来的伤害。乔永旭等[21]推敲发现, 化感物资肉桂酸作用下, 黄瓜(Cucumissativus L.)根旯旮细胞黏胶层增厚, 在一定经过上顽抗了化感恫吓对根尖的伤害。李安奇等[25]报说念, 当大豆根旯旮细胞受到土荆芥化感物资恫吓时, 根旯旮细胞周围形成了一些颗粒状物资, 可能与螯合化感物资连络。本推敲遵循标明, 紫茎泽兰索求物作用下, 3种杂草根旯旮细胞黏胶层厚度随索求物浓度的升高而权贵增厚。说明, 根旯旮细胞受到索求物化感恫吓, 向外开释了无数的化学物资, 以吸附或螯合索求物, 拦阻索求物进一步向细胞内渗入。这一甘愿与豌豆(Pisumsativum L.)根旯旮细胞受到铝恫吓[26]、玉米根旯旮细胞受到铜和土荆芥化感物资恫吓[11, 27], 出现根旯旮细胞黏胶层厚度增厚的甘愿相近似。由此可见, 根旯旮细胞黏胶层厚度加多是其应付化感恫吓的一种保护性生理响应。
植物受到外界恫吓时会产生一些济急机制来幸免自己受到严重的伤害, 举例产生更多的根旯旮细胞来顽抗恫吓[28]。根旯旮细胞的产生速度与果胶甲基酯酶(PME)密切关连, PME通过果胶去甲基化, 果胶酸剖判, 带领其它果胶酶基因的抒发, 最终促进根旯旮细胞从根冠开释[29]。本推敲遵循露馅, 稗草PME活性随索求物浓度的升高无赫然的变化, 而灰绿藜和反枝苋PME活性呈现随索求物浓度的升高而飞腾的变化趋势。出现这种遵循的原因可能是索求物恫吓带领杂草通过上调根冠细胞中PME基因的抒发, 使PME活性升高以促进根旯旮细胞的产生。关联词, 执行中3种杂草PME活性与RBCs数目变化趋势违反, 这可能是随索求物浓度的升高, 根尖组织受损加重, 产生根旯旮细胞的才气握住下落所致。
化感恫吓作用下, PME活性变化还与受体植物对化感恫吓的安然有密切关系, 对化感恫吓敏锐的受体植物PME活性变化较热烈[30]。本推敲遵循露馅, 随索求物浓度的升高, 稗草的PME活性变化不赫然, 而灰绿藜、反枝苋PME活性较赫然, 1000 mg/L索求物恫吓时, PME活性与其对照比均达到权贵相反。说明, 灰绿藜、反枝苋对索求物恫吓相比敏锐, 而稗草不敏锐。这也可从索求物恫吓下3种杂草种子萌生滋长筹办、索求物对根尖的毁伤不雅察遵循中得到印证。
4 论断紫茎泽兰索求物对稗草、灰绿藜、反枝苋种子萌生滋长有较热烈的化感恫吓作用, 阻难种子的萌生和幼苗滋长。紫茎泽兰化感物资阻难杂草根旯旮细胞的产生, 带领旯旮细胞发生凋一火, 破损根旯旮细胞对根尖的保护系统肛交 哭, 化感物资进一步对根尖产生恫吓伤害, 破损根尖的组织结构和细胞结构, 使根尖不成推崇往常的运输水分和养分代谢的功能, 从而阻难种子的萌生和早期幼苗的滋长。紫茎泽兰索求物可开拓成植物源除草剂, 用于3种杂草的绿色防控。